文献解析：多重免疫荧光染色结直肠肿瘤免疫微环境

文献解析：多重免疫荧光染色结直肠肿瘤免疫微环境

背景

结直肠癌肿瘤免疫微环境（TME）中蕴含着宿主抗肿瘤免疫应答与肿瘤免疫逃逸机制的关键生物标志物，其中T细胞亚群，如CD3⁺、CD8⁺ T细胞的密度已被证实比传统组织病理学分期更能精准预测疾病复发风险。此外，表达CD103的组织驻留记忆T细胞在结直肠癌等肿瘤的抗肿瘤免疫中发挥重要作用，其密度与患者长期肿瘤学结局相关。因此，精准表征TME中免疫细胞的表型、功能及空间分布，对发现新型预后标志物、指导免疫治疗策略具有重要意义。但传统显色免疫组织化学（IHC）技术存在标志物检测数量有限、共定位分析难度大、结果易偏差、耗时费力等局限。多重免疫荧光（mIF）技术可同步评估多种标志物，实现免疫细胞的精准分类及其与肿瘤组织的空间特征分析，为TME研究提供了理想工具。基于酪酰胺信号放大（TSA）的mIF技术无需考虑一抗的物种来源或免疫球蛋白亚类，且信号敏感性高、亮度强，优于传统间接免疫荧光技术。

因此Cohen R等人的研究“Optimising multiplex immunofluorescence staining for characterising the tumour immune micro-environment”通过基于自动化染色平台和普通荧光扫描仪的5色TSA-mIF检测体系，优化流程以精准表征结直肠癌TME中的免疫细胞。

实验设计

研究以含健康结肠上皮、不同级别结直肠腺瘤及腺癌的组织芯片和结直肠癌组织为样本，以CD3、CD8、CD103、细胞角蛋白（CK）为核心检测标志物，DAPI为核染色标志物。先通过显色IHC优化一抗浓度，再基于TSA技术进行单重荧光染色验证，随后评估不同荧光团在普通荧光显微镜扫描仪各通道的光谱串扰情况，探究检测标志物不同染色顺序对信号强度的影响。最终确定最优染色顺序，染色过程依托自动化染色平台，并采用双重分配荧光团添加策略，同时设置对照实验。采用StrataQuest v.7.1软件进行图像分析，先基于CK信号生成上皮组织与基质区域的掩码，再借助DAPI信号完成细胞核分割以识别单个细胞，随后叠加CD3、CD8、CD103信号，最终定量分析目标细胞在不同区域的密度，并通过计算一致性相关系数实现重复性验证。

一抗浓度优化及单重荧光染色验证

4种检测标志物，CD3、CD8、CD103、CK采用DAB显色，一抗设置不同稀释比和孵育时间。基于显色IHC优化的一抗条件，CD3、CD8、CD103用Opal 620标记，CK用TSA-Cy5标记，进行单重荧光染色，其结果与IHC染色一致。

单重荧光染色中荧光团光谱串扰评估

针对多重检测中的每种一抗与荧光团组合，对光谱串扰进行了细致评估。单重染色切片均在所有通道下进行扫描，以确定是否存在光谱串扰。CD8-TSA Cy3向SpRed通道轻微串扰，CD103-Opal Polaris 780向Cy5通道轻微串扰。该结果为后续荧光团分配和染色顺序优化提供了关键依据，可通过合理搭配标志物-荧光团组合、设置信号强度阈值等方式规避串扰对细胞分类的影响。

荧光团分配和染色顺序确定

在荧光团分配方面，首先针对 CD103 抗体洗脱困难的问题，为避免对后续步骤中组织和信号造成影响，将其设定为多重检测的最后一次染色，搭配 Opal Polaris 780 荧光团。将CD8-Opal 620，CD3-Cy3，CK-Cy5 3种标志物分别置于mIF染色序列的第1、2、3位，共设置6种排列组合。通过比较每种标志物在不同染色位置的信号强度，明确了最优顺序：CK-Cy5在三个位置均保持最稳定状态，CD8-Opal 620 在第三位染色时信号强度最强，CD3-Cy3 在第一位染色时信号最弱，最终确定整体染色顺序为CK→CD3→CD8→CD103。

多重免疫荧光结果展示

传统肿瘤微环境免疫细胞活性的组织病理学评估依赖训练有素的解剖病理医师对单色组织切片进行特征描述和半定量分析，而高性能数字图像分析软件的出现充分发挥了多重染色技术的优势，能够实现基于机器的自动化细胞识别、多标志物鉴定、背景空间定位及后续定量分析。本研究的多重检测面板采用奥地利 TissueGnostics 公司的 StrataQuest v.7.1 软件对单阳性、双阳性和三阳性细胞进行定量分析。先利用细胞角蛋白信号生成上皮组织和基质区域的掩码，再通过基于 DAPI 信号的细胞核分割算法识别单个细胞，随后基于 CD3、CD8 和 CD103 的表达情况，通过各标志物信号叠加并结合backgating技术确认双阳性和三阳性细胞的分类，最终通过计算机定量获得目标细胞的区域计数和面积测量数据。

参考文献

Cohen R, Lee-Pullen T, Miller TJ, Meehan K, Fuller K, McCoy MJ. Optimising multiplex immunofluorescence staining for characterising the tumour immune micro-environment. Methods. 2023 Nov;219:48-57. doi: 10.1016/j.ymeth.2023.09.004. Epub 2023 Sep 21. PMID: 37741563.    

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