文献分享：多重免疫荧光用于MCC肿瘤微环境研究

文献分享：多重免疫荧光用于MCC肿瘤微环境研究

背景

Merkel 细胞癌（MCC）是一种侵袭性皮肤神经内分泌癌，好发于老年人，免疫抑制人群发病率更高且发病更早，易复发、转移并导致死亡，亟需有效的预后评估与治疗手段。MCC 的发生存在两种不同通路：多数肿瘤由 Merkel 细胞多瘤病毒（MCPyV）克隆整合及致癌性病毒 T 抗原表达驱动；无 MCPyV 的肿瘤则因紫外线诱导的高肿瘤突变负荷引发。传统预测免疫治疗响应的指标（如 PD-L1 表达、肿瘤突变负荷）对 MCC 无效，而肿瘤微环境（TME）的精细分析或能更有效预测治疗响应。深入理解 MCC 相关 TME，可能为免疫治疗无效或不耐受的患者提供新的替代治疗思路。

将鼠源肿瘤细胞移植到基因背景相同的小鼠体内，能精准观察免疫调节剂对肿瘤的作用，是抗肿瘤免疫研究的重要工具。因此，Sun L等人的研究“Development of a Multiplex Immunofluorescence Assay for Tumor Microenvironment Studies of Human and Murine Merkel Cell Carcinoma” 利用多重免疫荧光（mIF）技术在单一组织切片同时可视化多种标志物，开发了适用于人类和小鼠MCC肿瘤TME研究的标准化mIF检测方法。

研究方法

先收集经伦理审批的人类MCC多余组织和遵循动物实验指南的小鼠MCC样本，均处理为福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片，再以MCC关键转录因子SOX2为核心肿瘤标志物，搭配T细胞、巨噬细胞及物种特异性功能标志物设计mIF实验，通过一抗浓度、抗原修复条件、染色顺序、荧光团选择等条件优化mIF实验，采用Opal 6-Plex试剂盒进行手动染色，经Mantra/Polaris平台成像后用InForm软件分析，最终通过与对应标志物的单重IHC结果对比、表型分析验证细胞群体识别准确性，评估荧光信号特异性及空间分布合理性。

一抗定位检测（单抗染色）

由于mIF检测中虽可通过微波处理进行一二抗洗脱，避免交叉反应或信号残留，但部分表位经多次微波处理后会降解甚至消失，另一些表位则会随多次微波处理增强信号，因此染色顺序不能随意设定，需预先确定各抗体的最优位置。实验采用表达目标标志物的阳性切片，实验组中测试一抗被安排在不同染色位置，对照组中一抗的位置则加入一抗稀释液，两组进行相同微波处理并以荧光团稀释液替代荧光团。随后通过荧光显微镜评估各位置的荧光强度，图中数据明确了标志物在不同染色位置的信号表现，其中阳性细胞信号强度至少为背景5-10倍的位置被确定为最优染色位置。

小鼠mIF标志物选择与染色验证

图中展示了小鼠MCC肿瘤样本中标志物的荧光团匹配及应用效果。SOX2因表达丰度高，搭配亮度较低的荧光团Opal 690；FOXP3的信号强度与染色位置表现支持搭配Opal 780；巨噬细胞标志物F4/80尽管对应通道自荧光较高，但信号表现稳定，故搭配Opal 480；Arg1搭配Opal 620，以最大化与F4/80的染色位置距离；CD3与CD8分别搭配Opal 520和Opal 570。图中清晰展示了小鼠MCC样本中的多重染色图及单通道图，同时另外4个小鼠MCC肿瘤样本的多重染色结果与之相似，且该多重染色结果与各标志物的单重IHC结果一致，表型分析也可准确检测到预期细胞群体。

人mIF标志物选择与染色验证

图中展示了人MCC肿瘤样本中标志物的荧光团匹配及应用效果。标志物选择与小鼠样本不同，CD3和SOX2作为高丰度抗原，分别搭配弱荧光团Opal 780和Opal 690；FOXP3因表达较弱搭配亮荧光团Opal 520；巨噬细胞标志物CD163预测可稳定表达，故搭配Opal 480以耐受组织中的自荧光干扰；PD-L1搭配Opal 620、CD8搭配Opal 570，分别实现与CD163、CD3的染色位置分离；最终序列中CD3位于CD8之后虽存在潜在空间位阻风险，但表型分析显示绝大多数CD8+细胞共表达CD3+，未出现分类误差。图中清晰展示了人MCC样本中的多重染色图及单通道图，且应用于3个另外样本的染色结果与之相似。

使用InForm进行结果分析

该分析流程分为四步：第一步单独、按特定组合以及整体查看各染色通道；第二步为细胞分割，界定图像中代表单个细胞的区域；第三步为表型分类，通过用户训练的算法解读标志物表达模式，为每个细胞分配表型，彩色圆点代表不同表型的细胞；第四步为定量分析，统计各细胞群体数量。结果显示：尽管Opal 780通道存在肿瘤细胞弱背景标记，但通过上述数字表型分析仍能正确分类SOX2+肿瘤细胞，有效区分T细胞上的真实CD3表达信号与肿瘤细胞上的非特异性假信号。人和小鼠两种肿瘤组织 CD3 与 CD8 的染色顺序接近，理论上存在空间位阻风险，但后续在R软件中完成的多重标志物CD3+/CD8 + 共表达检测中均未显著检测到CD3-/CD8+细胞，表明未出现因空间位阻导致的虚假检测结果，保证了检测准确性。且两种肿瘤组织mIF切片均适用于此种分析方法。

总结

本研究针对Merkel细胞癌免疫治疗响应预测不足及缺乏适配TME检测工具的临床与研究痛点，聚焦多重免疫荧光技术，成功开发并优化了适用于人类和小鼠MCC的标准化mIF检测程序。研究以高特异性MCC肿瘤标志物SOX2为核心，系统优化了抗体浓度、抗原修复条件、染色顺序及荧光团匹配等关键环节。通过系列结果图验证显示，人类和小鼠MCC两种染色体系均能精准可视化目标细胞群体，表型分析准确性高，可有效区分真实信号与非特异性背景，且无明显空间位阻，重复性良好。

参考文献

Sun L, Verhaegen ME, McGue J, Olivei AC, Dlugosz AA, Frankel TL, Harms PW. Development of a Multiplex Immunofluorescence Assay for Tumor Microenvironment Studies of Human and Murine Merkel Cell Carcinoma. Lab Invest. 2024 Oct;104(10):102128. doi: 10.1016/j.labinv.2024.102128. Epub 2024 Aug 23. PMID: 39182611; PMCID: PMC11502254.   

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